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JOURNAL OF NATURAL RESOURCES >

2022 , Vol. 37 >Issue 9: 2319 - 2333

DOI: https://doi.org/10.31497/zrzyxb.20220909

Special Issue of "Exploitation and Utilization of of Black Soil Resource"

Effects of corn-soybean rotation system on soil nitrogen-fixing bacteria community structure and quality in black soil

  • FENG Xue-wan , 1 ,
  • LI Cui-lan 1 ,
  • PENG Chang 2 ,
  • ZHANG Jin-jing 1 ,
  • LIN Yuan 1 ,
  • LIU Hang , 1
Expand
  • 1. Key Laboratory of Sustainable Utilization of Soil Resources in Commodity Grain Base of Jilin Province, College of Resources and Environment, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
  • 2. Institute of Agricultural Resources and Environment, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China

Received date: 2021-11-01

  Revised date: 2022-04-07

  Online published: 2022-12-28

Fold

Abstract

The effects of soybean continuous cropping (CS), maize continuous cropping (CM), corn-soybean rotation (MS), corn-corn-soybean (MMS) and corn-soy-soybean (MSS) on soil nitrogen fixing bacteria abundance and community structure were analyzed by fluorescence quantitative PCR and high-throughput sequencing. The results showed that soil organic matter (SOM), total phosphorus (TP), available nitrogen (AN) and available phosphorus (AP) contents in rotation were significantly higher than those in continuous cropping. The abundance of nitrogen-fixing bacteria in rotation was significantly higher than that in CM and significantly lower than that in CS. The diversity of NITR Ogen-fixing bacteria in MMS and MSS was significantly higher than that in CM. Total nitrogen (TN) was the main driving factor for the change of nitrogen-fixing bacteria community structure. Planting system indirectly affected the abundance and diversity of nitrogen-fixing bacteria through soil chemical properties. These results indicate that MSS and MMS are more conducive to the propagation of soil nitrogen-fixing bacteria in the semi-arid area of Western Jilin province, which can provide scientific basis for rational planting and nitrogen regulation from the perspective of microbiology.

Key words： continuous cropping; crop rotation; nitrogen-fixing bacteria community; fluorescence quantitative PCR; high-throughput sequencing

Cite this article

FENG Xue-wan , LI Cui-lan , PENG Chang , ZHANG Jin-jing , LIN Yuan , LIU Hang . Effects of corn-soybean rotation system on soil nitrogen-fixing bacteria community structure and quality in black soil[J]. JOURNAL OF NATURAL RESOURCES, 2022 , 37(9) : 2319 -2333 . DOI: 10.31497/zrzyxb.20220909

近年来,由于我国农业经济发展和集约化种植不断提高,东北黑土区作物种植方式主要以玉米、大豆连作为主。大豆连作会导致土壤酶活性降低[1]、土壤根系分泌物的自毒性增加[2]及土壤微生物群落不平衡[3]等一系列问题;连作使得土壤中的微生物类型由细菌向真菌转化,作物生长所需的养分过度流失,导致土壤肥力降低[4]。在高投入高生产这一经济模式下,黑土地土层日益变薄、土壤流失问题并未完全得到重视。产生这一问题的主要原因之一是黑土的持续高产主要靠化肥的大量投入,而没有根据黑土地目前的形势有针对性地调整轮作制度。因此,因地制宜地实行轮作等种植制度,更有利于黑土地的可持续发展。联合国粮农组织曾统计,通过生物固N作用全球结合态氮素可达2亿t,约占作物所需氮素的75%[6],大豆对全球固氮量有极大的贡献[7]。据报道,玉米—大豆轮作能够改善土壤氮循环,降低土壤氮库中氮素的缺损[8]。在生物固氮过程中,土壤固氮菌与N2结合[9],将植物不可吸收利用的N2转化为NH4+-N被植物吸收利用,对土壤氮循环有着不可替代的影响。
维持黑土地可持续生产,需要保持良好的土壤质量和健康的土壤环境,将保护性耕作下丰富的微生物原始信息转化为农业生态系统所依赖的土壤功能的认识是有价值的,能够更好地预测管理措施如何影响土壤微生物群落的组成（“谁在那里生活?”）及其功能（“它们在做什么?”）,将为有机种植的土壤构建和轮作系统提供一个强有力的工具。介导生物固氮的固氮菌拥有一种具有催化功能的固氮酶[10],固氮酶中的nifH基因已被广泛用于研究固氮菌的丰度和群落组成[11]。土壤固氮菌对土壤环境中的各种因素高度敏感,Poly等[12]曾报道土壤耕作措施、植被变化及土壤理化性质的改变均对其nifH基因有显著影响。目前,农业整治以耕地资源保护优化、管理环节为主[13],而种植制度是农业生产中的重要实践管理环节之一,因此研究土壤固氮菌的丰度及其群落结构是农业可持续发展的关键。在农业生态系统中,高通量测序技术已广泛应用于细菌和真菌的群落组成研究,但应用于固氮菌的群落组成研究较少[14]。为此,本文利用荧光定量PCR和Illumina Miseq高通量测序来分析土壤固氮菌nifH基因丰度和组成,通过微生物共线性网络分析和结构方程模型来阐述在不同种植制度下固氮微生物之间的关系以及与土壤养分的相互影响,揭示玉米—大豆轮作体系对土壤固氮菌群落结构的影响,明确玉米—大豆轮作和连作土壤固氮菌的丰度、群落组成及多样性的变化趋势及其对土壤化学性质的响应,比较连作和轮作条件下土壤固氮菌的网络结构。受不合理的耕作措施影响,东北地区部分黑土地土壤结构遭到破坏,严重威胁到中国粮食安全和东北地区的经济社会发展。因此,本文从生物固氮着手,提出种植模式的优选措施,为氮素的合理调控提供理论依据。

1 研究方法与数据来源

1.1 研究区概况

本文以吉林省农科院农业绿色发展试验区为研究平台,试验地点位于吉林省松原市宁江区民乐村（45.25°N,125.87°E）。民乐村属于中温带大陆性季风气候区,降雨集中在5~9月,年平均日照时数约2867 h,无霜期135~140 d,年平均气温5.6 ℃。

1.2 试验设计

试验开始于2018年,共设5个处理：大豆连作（CS）、玉米连作（CM）、玉米—大豆轮作（MS）、玉米—玉米—大豆轮作（MSS）、玉米—大豆—大豆轮作（MSS）,不设重复。每个大区共设8垄,垄长140 m,垄宽0.62 m,大区面积694.4 m2。播种前一次性施用复合肥（22-16-12）850 kg/hm2。设置试验后,施肥方式、种植密度、施肥量等田间管理与当地农户保持一致。在玉米种植期间施用玉米复合肥（N∶P∶K=26∶12∶12）750 kg/hm2,种植玉米7万株/hm2;在大豆种植期间施用大豆专用肥（N∶P∶K=11∶16∶18）590 kg/hm2,种植大豆20万株/hm2。于2020年9月采用“S”点取样法采集0~ 20 cm土壤样品,每个处理取三次重复,共采集15个土壤样品。采集后放入冰盒带回实验室,去除土壤样品中根系、石块等杂质,用2 mm的筛网进行筛分。土壤样品一部分放于-80 ℃的冰箱用于提取DNA,另一部分室温下风干用于土壤化学性质分析。

1.3 研究方法

1.3.1 试验方法

（1）土壤化学性质的测定
测定土壤化学性质的方法参考《土壤农业化学分析方法》（表1）[15]。
表1 土壤化学性质的测定方法

Table 1 Determination methods of soil chemical properties

化学性质 测定方法
土壤有机质SOM K2CrO7氧化—外加热法
pH pH计土壤pH (水土比为2.5∶1)
土壤全氮TN 凯氏定氮法
土壤全磷TP HClO4-H2SO4消解—钼锑抗比色法
土壤全钾TK 火焰分光光度计法
土壤速效氮AN 碱解扩散法
土壤速效磷AP 钼锑抗比色法
土壤速效钾AK 火焰分光光度计法
（2）土壤DNA提取
称取0.5 g鲜土,依据FastDNA® SPIN Kit for Soil （MP Biomedicals,USA）试剂盒说明提取土壤总DNA。用NanoDrop 2000 UV-Vis spectrophotometer（Thermo Scientific,USA）检测DNA浓度,DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
（3）土壤固氮菌nifH基因的荧光定量PCR
土壤固氮菌nifH基因PCR采用引物序列：nifH-F（5′-AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC-3′）和nifH-R（5′-TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT-3′）[16]。nifH基因的PCR反应体系和扩增条件见表2、表3。PCR扩增共进行30轮循环,延伸在最后一轮循环后完成。每个样本重复扩增三次。
表2 荧光定量PCR的反应体系

Table 2 Reaction system of fluorescence quantitative PCR

成分 体积/μL
nifH-F (10 μM) 1
nifH-R (10 μM) 1
SYBR®PremixEx Taq™II (TliRNaseH Plus),
ROX plus		 1
2×Taq Master Mix 25
水 22
总共 50
表3 荧光定量PCR的扩增条件

Table 3 Amplification conditions of fluorescence quantitative PCR

程序 温度/℃ 时间/秒
预变性 94 300
变性 55 30
退火 2 30
延伸 72 600
（4）土壤固氮菌nifH基因的高通量测序
采用nifH-F/nifH-R引物,在上游和下游引物的5′末端各添加8 bp条形码序列,以区分不同样本。PCR反应体系和反应参数见表4、表5。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳来检测扩增目的条带大小,并用Agencourt AM Pure XP核酸纯化试剂盒纯化。PCR产物用于构建微生物多样性测序文库,在北京奥维森基因科技有限公司进行测序。
表4 PCR的反应体系

Table 4 Reaction systems of high-throughput sequencing

成分 体积/μL
2×Taq Plus Master Mix 12.5
BSA (2 ng/μl) 3
Forward Primer (5 μM) 1
Reverse Primer (5 μM) 1
DNA (加入的DNA总量为30 ng) 2
dd H2O 5.5
总共 25
表5 PCR的反应参数

Table 5 PCR reaction parameters

程序 温度/℃ 时间/秒
预变性 95 300
变性 55 45
退火 72 50
（5）高通量测序数据的分析方法
下机数据通过QIIME（V1.8.0）软件,依照Barcode序列拆分样本,使用Pear（V0.9.6）软件对数据进行过滤、拼接。去除打分低值于20、有模糊碱基和错配引物的序列。拼接时10 bp为最小overlap,错配率为0.1。使用Vsearch（V2.7.1）软件denovo方法去除短序列和嵌合体序列。使用Vsearch（V2.7.1）软件UPARSE算法对优质序列进行OTU（Operational Taxonomic Units）聚类,相似性阈值为97%。为了确保所有样本的覆盖率都相当高,把所有样本的数据量均一化至25223条序列。与GenBank non-redundant nucleotide database（nt）数据库使用Blast算法进行比对,设置1e-5的阈值,得到每一个OTU所对应的物种分类信息。

1.3.2 统计分析方法

本文使用DPS（V9.01）软件,采用one-way ANOVA方法对土壤化学性质和固氮菌门相对丰度进行差异显著性分析;利用R（V3.4.2）软件的“pheatmap”“ggplot2”数据包绘制Heatmap图,非度量多维尺度分析（NMDS）利用R（Version 3.5）软件的vegan数据包制作;利用LDA Effect Size（LEfSe） （http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/）分析各处理间影响显著的Biomakes;利用Canoco（V5.0）软件绘制典范分析图（CCA）,阐明固氮菌群落与化学性质之间的关系。为了阐述作物、轮作制度、土壤化学性质、土壤固氮菌丰度和多样性之间的关系,利用Amos（V23）软件构建结构方程模型（SEM）,结构方程模型参数要求为：卡方检验P>0.05,自由度卡方比CMIN/DF<3,适应度指数 CFI>0.9;利用R（V3.4.2）软件的“Phych”数据包生成物种相关性矩阵,并借助Gephi（V0.9.2）软件绘制微生物网络图。

2 结果分析

2.1 玉米—大豆轮作和连作土壤的化学性质

与连作相比,三种轮作方式（MS、MMS、MSS）显著提高了AP、SOM的含量,MS显著提高了TP和AN的含量,MMS和MSS显著提高了TN的含量（表6）。AK在各处理间没有显著性差异。此外,对比不同轮作之间的土壤化学性质发现,与MS相比,MSS与MSS显著提高了TN、SOM的含量,但显著降低了AP的含量。
表6 玉米—大豆轮作和连作下土壤的化学性质

Table 6 Soil chemical properties under corn-soybean rotation and continuous cropping

处理 pH SOM
/(g/kg)		 TN
/(g/kg）		 TP
/(g/kg)		 TK
/(g/kg)		 AN
/(mg/kg)		 AP
/(mg/kg)		 AK
/(mg/kg)
CS 6.97±0.06ab 11.95±1.24c 1.87±0.01b 0.55±0..02c 22.53±0.31c 109.27±8.48b 22.28.±0.39b 156.17±3.01a
CM 6.90±0.09b 12.99±0.18c 1.80±0.04c 0.56±0.02c 25.53±1.03a 117.08±2.42b 22.28±2.68b 163.00±4.82a
MS 7.15±0.22ab 15.20±0.15b 1.88±0.01b 0.68±0.04a 24.93±1.45ab 132.03±11a 44.13±7.69a 162.50±15.52a
MMS 7.22±0.15a 16.83±0.48a 2.06±0.01a 0.65±0.05ab 24.73±0.23ab 123.67±0.67ab 36.62±2.61a 168.33±5.97a
MSS 7.20±0.18a 17.73±0.82a 2.09±0.03a 0.58±0.06bc 23.60±1.20bc 123.09±4.03ab 36.62±8.97a
159.50±1.80a

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著,下同。

2.2 玉米—大豆轮作和连作土壤固氮菌丰度和群落组成

与CM相比,土壤固氮菌丰度在MS、MMS、MSS中分别显著提高了2.33倍、 2.30倍、2.36倍,在CS中显著提高了7.81倍（图1）。与CS相比,土壤固氮菌丰度在MS、MMS、MSS中显著下降。
图1 玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌丰度（P<0.05,ANOVA差异分析）

Fig. 1 Soil nitrogen fixation bacteria abundance under corn-soybean rotation and continuous cropping (P < 0.05, ANOVA analysis)

利用高通量测序Illumina-MiSeq,从所有样品中获得1552409条优化序列,每个样本26825~168971条优化序列（表7）,优化序列长度200~540 bp,获得的数据在97%相似性水平上进行分类,检测得到了22个门、39个纲、84个目、147个科、319个属和2838个OTU。变形菌门（Proteobacteria）是玉米—大豆轮作和连作的优势菌门,其相对丰度为78.95%~98.81%;与CM相比,Proteobacteria的相对丰度在MS、MMS、MSS中分别显著提高了10.03%、8.78%、9.16%（P<0.05）;与CS相比,Proteobacteria的相对丰度在CM中显著降低了13.6%（图2a）。在属水平上,玉米—大豆轮作和连作之间也发生不同程度上的变化（图2b）,玉米和大豆在连作和轮作条件下优势菌属均为慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）,其相对丰度为24.5%~90.24%;与CS相比,Bradyrhizobium的相对丰度在MS、MMS、MS中分别显著降低了23.61%、40.33%、33.35%;与CM相比,Bradyrhizobium的相对丰度在MS、CS中分别显著提高了21.47%、45.61%。固氮根瘤菌属（Azorhizobium）的相对丰度在MMS中比CS显著提高了4.37%,在CS中比CM显著降低了3.68%;Azohydromonas的相对丰度在MS、MSS、MSS中比CS分别显著提高了2.81%、3.28%和1.63%,在MS与MMS中比CM显著提高了1.74%、2.21%,而在MSS中比CM显著降低了2.87%。与连作（CS、CM）相比,Methyloversatilis的相对丰度在MMS中显著提高了2.96%。与CM相比,Aromatoleum的相对丰度在MS、MMS、MSS中分别显著降低了1.51%、1.64%、1.39%,在CS中显著降低了1.72%。与CS相比,斯克尔曼氏菌（Skermanella）在MMS中显著提高了18.56%,在CM中显著提高了14.83%。
表7 土壤固氮菌nifH基因 Illumina MiSeq 高通量测序数据（97%相似度）

Table 7 Illumina MiSeq sequenced bacterial data (at 97% sequence similarity) based on the nifH gene

处理 序列/条 Final TAG OTU/个
CS1 142036 499
CS2 90760 324
CS3 106553 324
CM1 141014 576
CM2 71625 526
CM3 135340 557
MS1 26825 412
MS2 76579 436
MS3 155086 535
MMS1 142022 532
MMS2 142081 486
MMS3 73582 576
MSS1 143927 523
MSS2 168971 548
MSS3 31076 470
图2 玉米—大豆轮作和连作条件下Proteobacteria的相对丰度和土壤固氮菌优势菌属水平上的群落组成

注：*：P<0.05,ANOVA差异分析。颜色代表属相对丰度高低,粉色为低丰度,红色为高丰度。

Fig. 2 The relative abundance of Proteobacteria and the community composition at the level of the dominant genus of soil nitrogen-fixation bacteria under the conditions of corn-soybean rotation and continuous cropping

2.3 玉米—大豆轮作和连作土壤固氮菌群落的多样性

与CS相比,三种轮作方式（MS、MMS、MSSS）显著提高了Shannon指数,MMS与MSS显著提高了物种丰富度和物种均匀度（图3）,而CM的物种丰富度、物种均匀度和Shannon、Chao1指数均显著高于CS。
图3 玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌群落多样性指数

Fig. 3 Soil nitrogen-fixing bacteria community diversity index under corn-soybean rotation and continuous cropping

玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌群落结构的NMDS分析（图4a）可以看出,土壤固氮菌群落结构主要受种植方式影响。玉米、大豆连作和玉米—大豆轮作之间的土壤固氮菌群落结构有显著差异,MMS、MS、MSS之间距离较小,轮作之间固氮菌群落结构之间有一定的相似性。
图4 玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌群落的包作非度量多维尺度分析及土壤固氮菌群落结构和环境因子的典范对应分析

Fig. 4 Inclusion nonmetric multidimensional scale analysis (NMDS) of soil nitrogen-fixing bacteria community and canonical correspondence analysis (CCA) of soil nitrogen-fixing bacteria community structure and environmental factors under corn-soybean rotation and continuous cropping

LEfSe分析显示（图5）,在属水平上,对MSS起重要作用的菌属有假食酸菌属（Pseudacidovorax）、固氮螺菌属（Azospirillum）、井草螺属（Herbaspirillum）,对MMS起重要作用的菌属有固氮弗莱德门菌属（Friedmanniella）、Azohydromonas、根瘤菌属（Azorhizobium）,对MS起重要作用的菌属有慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）,对CM起重要作用的菌属有固氮弧菌属（Aromatoleum）、独岛杆菌属（Dokdonella）、短小杆菌属（Curtobacterium）、Pseudolabrys、Pleomorphomonas。
图5 LEfSe分析玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌的群落差异LDA分析柱状图（P<0.05：LDA score 2.0）

Fig. 5 LDA histogram of LEfSe analysis of soil nitrogen-fixing bacteria community difference under corn-soybean rotation and continuous cropping conditions (P < 0.05: LDA score 2.0)

2.4 玉米—大豆轮作和连作化学性质与土壤固氮菌群落结构的关系

CCA表明,TN是固氮菌群落结构变化的主要驱动因子（P<0.05）（表8）,且AK、OM、AN、TP、AP、pH、TN与MS、MMS、MSS呈正相关关系（图4b）。
表8 玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌群落结构和环境因子的典范对应分析的解释率和贡献率

Table 8 Explanation rate and contribution rate of canonical correspondence analysis of soil nitrogen-fixing bacteria community structure and environmental factors under corn-soybean rotation and continuous cropping

指标 解释率/% 贡献率/% P
SOM 4.1 6.6 0.764
pH 7.3 11.6 0.236
TN 12.4 19.6 0.01
TP 5.9 9.4 0.554
TK 11.5 18.3 —
AN 7.6 12.6 0.16
AP 7.9 12.6 0.146
AK 5.9 9.3 —
通过构建结构方程模型来揭示种植制度、种植作物、土壤养分含量对土壤固氮菌性状的直接和间接影响（图6）。SEM模型充分拟合了实验数据（χ2/df=1.772,P=0.056,CFI=0.996）,方程模型可解释94.3%的土壤固氮菌丰度变化和79%的土壤固氮菌多样性变化。SOM（λ=0.848）、pH（λ=0.503）、AN（λ=848）、TP（λ=0.983）、AK（λ=0.164）对土壤固氮菌丰度有直接影响,pH（λ=0.045）、SOM（λ=0.418）、TN（λ=1.151）、TP（λ=0.110）、AP（λ=0.062）、TK（λ=0.382）对土壤固氮菌群落多样性有直接影响,TN（λ=1.151）对土壤固氮菌多样性的影响程度最大,而种植制度通过pH、SOM、TN、TP、TK、AN、AP、AK对土壤固氮菌丰度和多样性有间接影响,作物通过pH、SOM、TN、TP、TK、AN、AP、AK对土壤固氮菌的多样性有间接影响。
图6 种植制度、作物、固氮菌性状和土壤养分含量间的结构方程模型

注：箭头宽度与通径系数的强度成正比。实线箭头表示正路径系数,虚线箭头表示负路径系数,灰色表示路径系数为0。*、**、***分别表示P< 0.05、P < 0.01、P < 0.001。

Fig. 6 The structural equation model (SEM) revealing that the width of the arrow was proportional to the strength of the path coefficient

2.5 玉米—大豆轮作和连作条件下固氮菌网络分析

网络分析表明,轮作固氮菌网络的边和平均度显著低于连作,而网络直径与平均路径长度显著高于连作（图7、表9）。一般认为,固氮菌网络图中的中介中心得分最高的OTUS被认为是关键类群。轮作中的关键类群为OTU2651（Proteobacteria）、OTU626（Cyanobacteria）;连作中的关键类群为OTU613（Proteobacteria）、OTU2338（Verrucomicrobia）、OTU44（Planctomycetes）、OTU2145（Bacteroidetes）。
图7 玉米—大豆轮作和连作土壤固氮菌共线性网络分析

注：节点颜色表示不同土壤固氮菌门,氮菌网络图红线表示两个节点之间的正相关,绿线表示负相关。

Fig. 7 Soil consolidation in corn-soybean rotation and continuous cropping

表9 土壤固氮菌网络的拓扑特征

Table 9 Topological characteristics of nitrogen-fixing bacteria network

处理 连作 轮作
节点/个 224 296
边/条 2530 693
平均度/(条/个) 28.657 6.037
网络直径/链路树 6 12
平均路径长度/链路树 2.682 4.719

3 结论与讨论

3.1 结论

轮作显著改善黑土的土壤化学性质,三种轮作方式土壤固氮菌的丰度相较玉米连作显著提高,但显著低于大豆连作;玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌的优势菌门是Proteobacteria,优势菌属是Bradyrhizobium;玉米连作Proteobacteria及Bradyrhizobium的相对丰度显著低于三种轮作方式,玉米—玉米—大豆轮作和玉米—大豆—大豆的土壤固氮菌的多样性和丰富度均显著高于大豆连作。NMDS和CCA分析得出,轮作和连作之间的土壤固氮菌群落具有明显差异,TN是影响固氮菌群落数量和多样性变化最主要的驱动因子,种植制度通过改善土壤化学性质影响着土壤固氮菌丰度和多样性。共线性网络图分析发现,轮作中土壤固氮菌之间有更好的合作关系,具有更丰富的固氮体系,并且轮作土壤能更好地缓冲外界干扰,表明轮作对黑土土壤物理性质和微生物质量产生正面影响。轮作提高黑土养分为作物健康提供了良好的环境,且玉米—玉米—大豆轮作和玉米—大豆—大豆轮作更有利于黑土中土壤固氮菌的生长和繁殖,为合理种植和氮素调控提供科学依据。《黑土地保护法》规定,需因地制宜地实行用地养地相结合的种植制度。本文研究发现,合理轮作制度可以优化生物固氮,进而降低化肥用量,减少生产成本,减少水土污染和土地荒漠化,满足了在用地的同时也进行了养地、在利用土地资源的同时也在保护土地资源的战略需求。但本文仍有不足,只通过高通量测序技术初步分析了黑土的土壤固氮微生物中属的变化,还需要进一步了解不同种植模式下土壤固氮微生物中关键类群对固氮作用的贡献。今后研究可以利用现代分子微生物技术,检测不同种群在生物固氮的作用,为合理种植提供更科学的依据。在实行黑土地保护和治理中总会遇到困难,想要真正解决黑土地退化的问题,就必须改变基本理念,推动黑土地保护工作,不断开展创新局面。

3.2 讨论

3.2.1 玉米—大豆轮作和连作对土壤固氮菌丰度和群落结构的影响

研究发现,与CM相比,轮作显著提高了土壤固氮菌丰度,而CS中的土壤固氮菌丰度显著高于其他处理（图1）,说明nifH基因的丰度受种植制度和作物种类双重影响。土壤固氮菌相对丰度的增加与土壤养分含量密切相关,轮作土壤中的养分含量较高,可以为土壤固氮菌数量的增加提供良好条件[17]。与大豆连作相比,轮作显著降低了土壤固氮微生物的相对丰度,这主要与作物类型有关,豆科作物根系分泌的信号分子可以促进根瘤菌的基因表达,更有利于根瘤菌的生长和繁殖[18]。此外,难溶的营养物可被大豆分泌的脂肪酸活化,可为微生物生长和繁殖提供大量营养物质[19,20]。然而玉米作为禾本科植物其主要氮素来源于土壤,Keeling等[21]研究表明土壤固氮微生物的活性与C/N相关,在生长期间玉米吸收了大量氮素,造成了土壤C/N失调[22]从而影响土壤固氮微生物活性。Brandan等[23]指出长期大豆连作中nifH基因的丰度显著低于玉米—大豆轮作,这表明种植制度对土壤固氮菌丰度的影响还与种植年限相关。土壤固氮菌中的固氮酶对铵态氮敏感,土壤中铵态氮含量过高会对土壤固氮菌产生负面影响[24⇓-26],然而长期种植大豆的土壤的NH4+-N含量相对于其他作物较高[27],由于作物积累效应,可能造成土壤中NH4+-N过高从而抑制nifH基因的丰度。
Proteobacteria是玉米—大豆轮作和连作土壤固氮菌的优势菌门（图2）。Ding等[28]研究也发现黑土生态系统中固氮菌以Proteobacteria为主,Bradyrhizobium是玉米—大豆轮作和连作中优势菌属（图2）。Silva等[14]也发现Bradyrhizobium是豆科作物轮作系统中的优势菌属。与CM相比,玉米—大豆三种轮作方式显著提高Proteobacteria的相对丰度（图2a）。Coelho等[29]在高粱与豆科作物轮作土壤中发现高丰度α变形菌,nifH序列聚集在不同的分类群中[30],包括α-变形菌、β-变形菌和γ-变形菌以及革兰氏阳性菌,然而,大约50%的固氮还原酶基因来自α-变形菌的近缘菌,它们大部分能够与豆科植物结瘤。轮作中Bradyrhizobium的相对丰度比CM显著提高,比CS显著降低（图3）,Bradyrhizobium主要与豆科作物形成根瘤进行共生固氮,是豆科作物的生长促进剂[31⇓-33]。与CS相比,轮作显著提高了Azohydromonas的相对丰度。Coelho等[34]从高粱根际土中提取出Azohydromonas,Azohydromona更有利于禾本科植物的生长和繁殖。Zou等[35]的研究结果显示,大豆连作中Bradyrhizobium的相对丰度最高,相比大豆连作、玉米连作,轮作显著提高Azohydromonas、Bradyrhizobium的相对丰度,说明大豆种植更有利于Bradyrhizobium繁殖。MSS的Azorhizobium相对丰度显著高于CS（图3）,Azorhizobium主要存在于非豆科作物中,作为一种联合固氮菌,不但具有固氮能力,还有促进宿主或非宿主生长能力[36]。与连作（CS、MS）相比,MSS显著提高了Methyloversatilis的相对丰度（图3）,Methyloversatilis属于红环菌科,红环菌科均有固氮能力,属于非共生固定[37]。轮作中Aromatoleum的相对丰度显著低于CM（图3）,说明Aromatoleum更适合在种植禾本科作物的土壤中生长,与土壤氮循环密切相关[38]。与CS相比,MMS与CM显著提高了Skermanella的相对丰度,Hu等[39]在长期玉米连作的土壤中发现大量的Skermanella,说明玉米种植更适合Skermanella的生长和繁殖。综上所述,轮作土壤中含有更丰富的共生固氮菌和非共生固氮菌,其固氮效率相比连作更高。
MMS与MSS的Shannon、物种均匀度和物种丰富度指数均显著高于CS（图3）,这与周岚等[40]和丁俊男等[41]的研究结果一致,MSS中大豆的固氮作用保持了土壤中的氮含量,稳定了土壤固氮菌的群落结构[42]。Zou等[35]的研究表明,玉米连作显著提高土壤固氮菌多样性,这与本文结果一致,原因是玉米连作土壤中NO3--N和NH4+-N的含量低于轮作,从而影响了土壤氮矿化,稳定了土壤有机氮和无机氮之间的平衡[43]。NMDS分析发现：连作和轮作之间土壤固氮菌群落结构有明显差异,轮作处理之间土壤固氮菌群落结构有一定的相似性（图4a）。土壤固氮菌和作物之间的化感作用是土壤形成不同土壤固氮菌群落的主要原因,大豆和玉米向土壤分泌不同的根系分泌物,诱导土壤固氮菌在土壤中定植繁殖,从而影响土壤固氮菌群落结构的组成[44]。

3.2.2 影响土壤固氮菌群落结构的环境因子

本文研究表明,驱动土壤固氮菌群落结构变化的主要因子是TN（图4b、表8）。蔡树美等[45]的研究结果也表明,TN是驱动土壤固氮菌群落结构变化的重要因子,TN与土壤固氮菌群落组成和数量密切相关,是微生物生长的主要限制因子,土壤中氮素的缺失会抑制土壤固氮菌生长和繁殖[46]。SEM结果显示,SOM、pH、AN、TP、AK对土壤固氮菌丰度有直接影响,且pH、SOM、TN、TP、AP、TK对土壤固氮菌群落多样性有直接影响,说明在玉米—大豆轮作和连作条件下土壤化学性质是影响土壤固氮菌数量和群落结构的重要因子。Cai等[47]的研究结果也表明,在轮作体系中土壤固氮菌丰度与SOM呈正相关关系,土壤固氮菌多样性与AK、TN、SOM呈正相关关系。本文研究表明种植制度对土壤固氮菌丰度和多样性有间接影响,而作物对土壤固氮菌的多样性有间接影响（图6）,说明土壤固氮菌的丰度和多样性与种植作物类型及管理措施等因素有关。Han等[48]研究表明,不同类型作物与土壤固氮菌多样性呈正相关关系,作物根系分泌物影响土壤养分状况,直接影响固氮菌之间的竞争力,导致固氮菌群落数量、组成及结构发生变化[49]。

3.2.3 玉米—大豆轮作和连作条件下土壤固氮菌的网络分析

利用网络分析研究发现（图7）,轮作中的土壤固氮菌节点显著高于连作,但边显著低于连作（表9）,而Hu等[50]的研究则表明轮作的边和点都显著高于连作。与连作相比,轮作显著提高了网络直径和平均路径长度（图7）,说明轮作比连作更能缓冲外界干扰[51],而轮作中的平均度显著高于连作,这意味着轮作土壤固氮菌OTU之间具有更多的合作关系。通常高中介中心的OTUS被认为是网络中的关键类群,在轮作中的关键类群是OTU2651（Proteobacteria）、OTU626（Cyanobacteria）。据报道,Cyanobacteria的固氮能力强,可为作物提供大量的可利用氮素[52],而连作中的关键类群为OTU613（Proteobacteria）、OTU2338（Verrucomicrobia）、OTU44（Planctomycetes）、OTU2145（Bacteroidetes）,关键类群中的疣微菌门（Verrucomicrobia）极富生态多样性,对环境耐受力强,具有降解烃类的能力,Verrucomicrobia分泌的次级代谢物不利于植物生长[53]。综上,轮作是提高生物固氮和改善黑土环境的重要环节。

3.2.4 社会生态效益分析

对于生物固氮,如何配置种植体系,将固氮效率发挥最佳是我们目前需要克服的难题。研究表明,优秀的配置体系可以减少50%的氮肥用量[6],但固氮菌对外界环境敏感,恶劣的环境严重地影响了固氮菌活力,限制了生物固氮在农业中的作用。本文研究发现,在玉米—玉米—大豆轮作和玉米—大豆—大豆轮作的土壤中具有更多样化的生物固氮体系（图2）,可以有效地提高固氮效率,保持土壤肥力（表6）,遵从了黑土“以养结合,以防治理”的基本思路。农业研究和世界粮食的观念已发生根本性的转变,以前农业发展的主动驱动力是最大限度地提高作物的生产力,而我国黑土已付出了土壤贫瘠的代价。如今需要追求的是生产力和可持续性相结合,若想要保持农业长期可持续性,就必须补充从土壤中流失的养分。对于氮的输入,将大气中的氮素转化为植物可利用氮素的生物固氮可减少过度施用氮肥造成的土壤退化等问题,对支撑“粮藏于地”战略具有重大意义[6]。我国农业发展需要更广泛更多样化的种植制度,实现种植方式的转变,未来政策应向农业管理措施方面给予更多的鼓励。

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