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2022 , Vol. 37 >Issue 9: 2306 - 2318

DOI: https://doi.org/10.31497/zrzyxb.20220908

“黑土资源持续利用和开发”专栏

不同施肥方式对东北旱田黑土nirK和nirS型反硝化细菌群落结构的影响及黑土保护建议

  • 喻江 , 1, 2 ,
  • 李彦生 1 ,
  • 谢志煌 1 ,
  • 高志颖 1, 3 ,
  • 刘晓冰 1 ,
  • 于镇华 , 1
展开
  • 1.中国科学院东北地理与农业生态研究所/中国科学院黑土区农业生态重点实验室,哈尔滨 150081
  • 2.哈尔滨商业大学东北亚服务外包研究中心博士后工作站,哈尔滨 150028
  • 3.东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨 150030
于镇华（1984- ）,女,黑龙江北安人,博士,副研究员,硕士生导师,主要从事土壤微生物生态研究。E-mail:

喻江（1983- ）,女,黑龙江齐齐哈尔人,博士,讲师,主要从事土壤微生物生态研究。E-mail:

收稿日期: 2021-10-08

  修回日期: 2022-04-07

  网络出版日期: 2022-12-28

基金资助

国家重点研发计划资助(2021YFD1500400)

中国科学院青年创新促进会项目(2019233)

哈尔滨商业大学博士科研启动项目(2019DS103)

收起

Effects of fertilization managements on nirK/nirS-type denitrifying bacterial community structures in upland black soils of Northeast China and suggestions for protecting black soil resource

  • YU Jiang , 1, 2 ,
  • LI Yan-sheng 1 ,
  • XIE Zhi-huang 1 ,
  • GAO Zhi-ying 1, 3 ,
  • LIU Xiao-bing 1 ,
  • YU Zhen-hua , 1
Expand
  • 1. Key Laboratory of Mollisols Agroecology, Northeast Institute of Geography and Agroecology, CAS, Harbin 150081, China
  • 2. Post Doctoral Workstation of Northeast Asia Service Outsourcing Research Center, Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China
  • 3. College of Resources and Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Received date: 2021-10-08

  Revised date: 2022-04-07

  Online published: 2022-12-28

Fold

摘要

反硝化过程是土壤氮素循环的重要过程之一,与土壤氮肥损失和温室气体排放紧密相关。通过分析不同施肥方式对东北旱田黑土nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构的影响及其与N2O排放的关系,证实黑土中nirK型比nirS型反硝化细菌多样性丰富,且更易受土壤理化性质的影响。施入化肥会降低东北旱田黑土反硝化细菌多样性、N2O释放量和土壤养分含量,而有机肥的施入虽然可提高土壤养分含量,但是也会显著增加土壤反硝化作用,存在潜在的负面环境效应。因此对黑土地的保护要积极推行种养结合,建立可循环农业体系;适当配施有机肥料,调节黑土微生物活力;大力完善相关制度,营造科学管理新规范,从而构建我国黑土保护的立体格局。

关键词： 有机肥; 反硝化作用; 微生物多样性; N2O

本文引用格式

喻江 , 李彦生 , 谢志煌 , 高志颖 , 刘晓冰 , 于镇华 . 不同施肥方式对东北旱田黑土nirK和nirS型反硝化细菌群落结构的影响及黑土保护建议[J]. 自然资源学报, 2022 , 37(9) : 2306 -2318 . DOI: 10.31497/zrzyxb.20220908

Abstract

Soil denitrification is one of the important processes of soil nitrogen cycling, which is closely related to soil nitrogen loss and greenhouse gas emissions. The relation between communities and the release of N2O was analyzed in this study. The results showed that regardless the fertilization treatments, nirK type denitrifying bacteria had higher diversity than nirS type denitrifying bacteria, which were more susceptible to soil physical and chemical properties. Application of chemical fertilizer decreased soil nutrient content, the diversity of denitrifying bacteria and the release of N2O, while organic fertilizer (F+M and F+2M) application significantly increased the soil denitrification. Therefore, application of chemical fertilizer is not conducive to maintaining the fertility of black soil. Although the combined application of chemical fertilizer and organic fertilizer can improve soil fertility, the potential negative environmental effects can not be ignored. So, we suggested that the protection of black soil should actively promote the planting and breeding integrated mode, construct the recyclable agricultural system; appropriately apply organic fertilizers, regulate the activities of soil microbials; improve the relevant institutions, create new norms of scientific managements, and finally construct the multi-directional patterns for the protection of farmland in black soil region of Northeast China.

Key words： organic fertilizer; denirtrification; microbial community diversity; N2O

东北黑土区是我国重要的粮食生产和商品粮输出基地,其粮食产量占全国总产量20%以上,外调到华东、华南、华北等粮食主销区的商品粮占全国商品粮总量的60%以上[1]。黑土地是东北粮食生产的基石,保护东北黑土地是构建我国耕地保护新格局,保障国家粮食安全的重要基础措施。然而,长期不合理的耕作和高强度利用导致黑土农田有机质含量下降、理化性状与生态功能退化[2⇓-4],加之土壤侵蚀,黑土区正面临着“量减质退”的窘境。东北黑土区正由“生态功能区”开始向“生态脆弱区”演变,影响黑土资源的开发和利用,更严重威胁黑土区农业持续发展和国家粮食安全。增施有机肥被公认为可以促进作物增产且实现黑土地保护的有效措施之一。有机肥的施入可增加土壤有机质含量,改善土壤理化性状,增加土壤酶活性,提高土壤微生物活性和丰度,持续提升耕地基础地力[5⇓⇓⇓-9]。研究表明,在小麦水稻轮作系统中,50%的有机肥代替化肥不仅可以降低磷素损失,提高磷素利用率,也可提高小麦和玉米的产量[10]。在化肥减量10%~30%的条件下,再配施等量有机肥后也可改善根际土壤微生态环境[11]。因而,增施有机肥是提高黑土地综合生产能力的重要措施之一。前期针对有机粪肥对东北土壤有机碳库的研究表明,0~20 cm土层单施化肥、化肥配施7.5 t·hm-2有机粪肥、化肥配施15 t·hm-2有机粪肥和化肥配施22.5 t·hm-2有机粪肥,分别比不施肥处理的碳存储（C storage）增加了3.19%、12.5%、14.5%和18.2%,且有机肥的施入对提高土壤总有机质含量、活性碳库和惰性碳库有显著作用[12]。此外,旱田黑土中长期有机肥的施入不仅改变了土壤理化性质,也为土壤微生物提供了丰富的底物和能源,促进其生长繁殖,增加其生物多样性,这其中不乏反硝化细菌。由反硝化细菌介导的反硝化作用是旱田土壤氮素转化的重要过程之一[13,14]。
反硝化过程作为氮素循环过程的中心环节之一,不仅造成农田生态系统中氮肥的大量损失,同时也释放强效温室气体N2O,破坏大气环境[15]。其中,亚硝酸盐（NO2-）还原为NO的过程是第一步产气过程,也是反硝化过程的限速步骤[16,17]。这一步骤由两种功能基因nirK和nirS编码的亚硝酸还原酶控制催化,两种基因虽功能相似,但分别属于不同的细菌菌属[18]。因此,nirK和nirS基因常被用于反硝化过程研究的目标基因。研究表明,nirK和nirS基因的丰度与不同土壤环境因子有关[19,20],nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构也易受施肥方式影响[21,22]。然而,东北旱田黑土中单施化肥和化肥配施有机肥对nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构的影响仍有待研究,其对黑土质量的影响也有待探讨。
基于以上问题,同时也为了更好地贯彻国家有关部委颁布的《东北黑土地保护规划纲要（2017—2030年）》《东北黑土地保护性耕作行动计划（2020—2025年）》和《黑龙江省“十四五”黑土地保护规划》等文件精神,实施黑土保护国家战略,践行习近平总书记对于黑土保护的指示精神,保护好、利用好黑土地。本文依托中国科学院海伦水土保持监测研究站,采用Illumina高通量测序方法,对比研究了化肥和化肥配施有机肥对东北旱田黑土N2O排放以及nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构特征的影响,及其与主要土壤因子的相关关系。旨在为优化黑土旱田肥料管理措施、减少农田氮素损失和温室气体减排提供理论参考,并为黑土质量提升和黑土资源的合理利用提出建议,对黑土区综合生产能力的提高和农业绿色可持续发展具有指导意义。

1 研究方法与数据来源

1.1 试验设计和土壤样品采集

试验地点位于黑龙江省海伦市前进乡光荣村中国科学院海伦水土保持监测研究站（47°21′N,126°49′E）。该地区土壤为典型黑土,气候为北温带大陆性季风气候,冬季寒冷干燥,夏季高温多雨,年均温1.5 °C,降雨量500~600 mm[12]。小区面积8 m×5.36 m,8行区,采用完全随机区组设计,大豆玉米短期轮作,设置四种不同施肥处理,分别为：（1）无肥（NoF）;（2）单施化肥（CF）,种植大豆年份施氮肥55.2 kg·hm-2、磷肥35.2 kg·hm-2和钾肥22.4 kg·hm-2,种植玉米年份施氮肥66.8 kg·hm-2、磷肥35.0 kg·hm-2和钾肥22.4 kg·hm-2;（3）化肥配施有机肥（F+M）,在化肥基础上施入有机肥 15 t·hm-2;（4）化肥配施加倍有机肥（F+2M）,在化肥基础上施入有机肥30 t·hm-2。本文所用的有机肥是当地农户散养奶牛的粪便自然沤制形成的,基于干重计算每千克有机肥中含有碳、氮、磷和钾的含量分别为454 g、20.7 g、7.93 g和11.8 g[23]。自2011年开始,有机肥于每年秋收后施入,化肥作为基肥在每年春季播种时施入,于2016年10月20日大豆收获后采集耕层土壤样品。每个处理小区平均划分为三个区域作为三次重复,每个重复内随机选取三点土壤样品混匀后放于封口袋中用冰盒带回实验室,手工剔除植物残体和石块后,根据不同试验要求,将样品自然风干或分别保存在4 °C和-80 °C冰箱,尽快对土壤基本理化性质、反硝化潜势和微生物总DNA进行测定或提取。

1.2 土壤理化性质测定

土壤pH用pH计测定（METTLER TOLEDO,FiveEasy Plus FE20,水土比为2.5∶1）。土壤全碳（total carbon）含量和全氮（total nitrogen）含量采用元素分析仪（VarioEL III,Germany）测定;土壤全磷（total phosphorus）、有效磷（available phosphorus）、铵态氮（ammonium nitrogen,NH4+-N）和硝态氮（nitrate nitrogen,NO3--N）采用连续流动分析系统（SKALAR SAN++ Netherlands）测定[17];土壤全钾（total potassium）和速效钾（available potassium）利用火焰光度计（ICPS-7500,Shimadzu,Japan）测定[24];土壤水溶性有机碳采用TOC仪测定[25]。

1.3 反硝化潜势测定（Soil Denitrification Potential,DEA）

反硝化潜势采用乙炔还原法测定[26]。称取4 °C冰箱保存的土壤样品20 g于自行改制的100 mL培养瓶中,瓶盖配有胶塞,可插入针头,针头拔出后针孔可自动闭合,且不影响培养瓶的密闭性。加入20 mL灭菌水,盖上橡胶塞和铝压盖,将两个针头插入瓶内,一个针头插入瓶体较深位置用于充入高纯氮气（N2）,另外一个针头插入到瓶体较浅位置用于排除空气,通入高纯氮气约10 min充分排除瓶内空气。然后,从瓶中抽取15 mL（V/V）氮气,再注入等体积乙炔,摇床180 rpm充分振荡1 h使气体和土壤充分混匀,再将培养瓶置于25 °C培养箱避光培养24 h。培养结束后,用注射器从培养瓶中抽取1 mL气体,用气相色谱仪（Shimadzu GC 2010,Shimane,Japan）分析N2O浓度,折算成单位时间内每千克干土N2O的释放量来表征DEA。

1.4 土壤微生物总DNA提取

称取0.5 g保存在-80 °C冰箱的冰冻土壤样品,采用Fast DNA SPIN Kit for Soil 试剂盒（Qbiogene Inc.,Carlsbad,CA,USA）提取土壤微生物总DNA,操作过程参照试剂盒说明书。反硝化细菌功能基因nirK采用引物F1aCu（5'-ATCATGGTSCTGCCGCG-3'）和R3Cu（5'-GCCTCGATCAGRTTGTGGTT-3'）扩增,nirS基因以cd3aF（5'-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3'）和R3cd（5'-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3'）为特异性引物扩增[27],反应体系均为25 μL,含12.5 μL PCR Mix,正向反向引物各0.5 μL（10 μmoL）,DNA模板0.5 μL,用灭菌超纯水补足至25 μL。PCR扩增程序为：94 °C预变性2 min;94 °C变性30 s、57 °C退火30 s、72 °C延伸45 s,6个循环;94 °C变性30 s、52 °C退火30 s、72 °C延伸45 s,30个循环。PCR产物用Agarose Gel DNA Purification Kit（TaKaRa）纯化后等量混合,委托上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。

1.5 高通量测序及数据分析

高通量测序基于Illumina PE 300平台,基于97%的相似度水平进行OTUs（Operational taxonomic unit）分类单元划分,计算Chao1指数、Shannon指数和ACE指数 （http://mothur.org/wiki/Calculators）,采用R软件（version 3.2.5）vegan数据包基于bray-curtis距离进行PCoA分析[28,29],在美吉生物云平台 （https://cloud.majorbio.com/）完成反硝化细菌物种组成分析、样本比较分析和环境因子关联分析。不同处理之间土壤理化性质的差异、DEA与理化性质及主要群落组成相关性分析及方差分析均采用SPSS 22.0软件完成。所有序列已提交GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）（BioProject Accession Number,PRJNA733322）。

2 结果分析

2.1 不同施肥处理对土壤理化性质的影响

施用化肥或化肥配施有机肥后,除全磷和全钾外,大部分已测的土壤理化性质均发生显著变化。如表1所示,与NoF相比,CF处理的速效钾、有效磷和pH虽有所降低,但差异不显著;而施入有机肥后,其含量均显著增加,且随有机肥配施比例的增加而升高;F+M和F+2M处理的速效钾、有效磷和pH分别显著增加了30%~73.3%、69.8%~89.5%和9.35%~24.30%（P<0.05）。同时,不同施肥处理使NH4+含量降低了2.86%~4.65%,而NO3-含量显著增加了15.15%~78.04%（P<0.05）;CF处理中水溶性有机碳含量降低了5.8%,增施有机肥后水溶性有机碳含量降低了18.8%~31.0%,且F+M中水溶性有机碳含量低于F+2M;除F+2M的C∶N较CF显著降低11.05%外（P<0.05）,其余处理间差异均不显著。可见,与NoF相比,化肥的施入可以降低土壤养分含量,而有机肥的施入可改善土壤养分状况。
表1 不同施肥处理土壤基本理化性质

Table 1 Basic soil chemical and physical properties of different fertilization treatments

施肥
处理		 速效钾
/(mg·kg-1)		 有效磷
/(mg·kg-1)		 水溶性有机碳
/(mg·kg-1)		 铵态氮
/(mg·kg-1)		 硝态氮
/(mg·kg-1)		 pH 含水量
/%		 碳∶氮
C∶N
NoF 154.76±11.89c 39.18±17.07b 85.22±10.49a 129.16±2.15a 11.75±1.48c 5.35±0.04c 28.91±0.83a 14.49±0.73ab
CF 147.15±10.01c 38.53±13.64b 80.25±7.35a 123.15±1.78b 13.53±0.44ab 5.33±0.08c 29.97±1.11a 15.02±0.80a
F+M 201.93±24.15b 66.54±16.92a 58.77±8.08a 125.47±3.57ab 14.56±0.35b 5.85±0.45b 32.47±1.18b 13.91±0.43ab
F+2M 268.16±26.64a 74.23±3.40a 69.17±32.95a 124.46±0.57b 20.92±1.18a 6.65±0.17a 32.82±0.76b 13.36±0.25b

注：同一列不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）,下同。速效钾、有效磷、pH和碳、氮数据引自文献 [30]。

2.2 不同施肥处理土壤反硝化潜势

与NoF比较,CF处理未对反硝化潜势产生显著影响（图1）,但化肥配施有机肥后土壤反硝化潜势呈增加趋势,F+2M处理的土壤反硝化潜势较NoF和CF处理分别增加102.56%和113.38%（P<0.05）。
图1 不同施肥处理土壤反硝化潜势

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）,下同。

Fig. 1 Denitrification potential of different fertilization treatments

2.3 nirK型和nirS型反硝化细菌α多样性分析

对反硝化细菌基因nirK和nirS进行高通量测序,分别获得176144条和189114条有效序列,基于最小序列数目抽平后分别可划分为1014个和197个OTUs。通过α多样性分析可以看出,nirK型反硝化细菌Chao1指数、Shannon指数和ACE指数明显高于nirS型反硝化细菌,证实东北旱田黑土中nirK型比nirS型反硝化细菌多样性更高。
比较不同施肥处理α多样性指数可以看出,CF和F+M处理的nirK型反硝化细菌Shannon指数较NoF相比差异不显著,但F+2M可显著增加Shannon指数;而不同施肥处理对nirS型反硝化细菌的Shannon指数影响不显著（图2b）。由图2a和图2c可以看出,与NoF相比,单施化肥（CF）对nirK型反硝化细菌Chao1指数和ACE指数影响不显著,化肥配施有机肥（包括F+M和F+2M）可显著增加Chao1指数和ACE指数（P<0.05）;而对于nirS型反硝化细菌,F+2M可显著增加Chao1指数和ACE指数,F和F+M对其影响不显著,但不同施肥之间差异显著（P<0.05）。说明单施化肥对旱田黑土nirK型反硝化细菌多样性无显著影响,但化肥配施有机肥后可显著增加其多样性,尤以nirS型反硝化细菌在F+2M处理中差异最大。
图2 nirK型和nirS型反硝化细菌α多样性指数

Fig. 2 α-diversity indexes of nirK and nirS denitrifying bacteria

2.4 nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构和β多样性分析

群落结构分析结果表明（图3）,在门水平方面,nirK型反硝化细菌主要来自未分类细菌（28.64%~36.05%）、环境样品（8.61%~13.49%）、变形菌门（Proteobacteria,47.29%~51.65%）、未分类成分（2.15%~9.62%）和其他（0.39%~0.96%）,不同施肥处理差异均不显著,其已确定的菌门除变形菌门外,在其他中还包括广古菌门（Euryarchaeota,0.40%~0.96%）（表2）。而对于nirS型反硝化细菌,变形菌门是唯一确定菌门,不同施肥处理中nirS型反硝化细菌变形菌门相对丰度仅为9.84%~27.77%,显著低于nirK型反硝化细菌的变形菌门,未分类细菌和环境样品分别占52.77%~64.52%和19.44%~25.64%。
图3 门水平nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构

Fig. 3 Community structure of nirK and nirS denitrifying bacteria at the phylum level

表2 具有明确分类的nirK型和nirS型反硝化细菌相对丰度

Table 2 Relative abundances of identified nirK and nirS denitrifying bacteria

nirK nirS
NoF CF F+M F+2M NoF CF F+M F+2M
门
Protobacteria 50.46a 47.29a 51.65a 51.33a 14.01 9.84a 19.10a 27.77a
Euryarchaeota 0.40a 0.96a 0.39a 0.65a — — — —
纲
Gammaproteobacteria — — — — 7.75a 6.04a 12.93a 21.79a
Alphaproteobacteria 38.14a 34.31a 35.22a 28.69a 2.19a 1.28a 1.19a 0.95a
Betaproteobacteria 9.03a 7.88a 9.45a 12.88a 1.76a 0.52a 1.37a 1.10a
Halobacteria 0.40a 0.96a 0.39a 0.65a — — — —
目
Xanthomonadales — — — — 7.75a 6.04a 12.93a 21.79a
Halobacteriales 0.40a 0.96a 0.39a 0.65a — — — —
Nitrosomonadales 8.94a 7.84a 8.82a 5.63a — — — —
Rhizobiales 38.04a 34.19a 34.64a 26.84a 2.19a 1.28a 1.19a 0.95a
Burkholderiales 0.09a 0.04a 0.63a 7.26a — — — —
科
Bradyrhizobiaceae 32.48a 26.50a 21.53a 17.60a 2.19a 1.28a 1.19a 0.95a
Nitrosomonadaceae 8.94a 7.84a 8.82 5.63a — — — —
Phyllobacteriaceae 3.58a 4.93a 3.46a 1.42a — — — —
Alcaligenaceae 0.09a 0.04a 0.63a 7.26a — — — —
Rhizobiaceae 0.10a 0.02a 2.07a 0.29a — — — —
Halobacteriaceae 0.40a 0.96a 0.39a 0.65a — — — —
Hyphomicrobiaceae 0.13a 0.11a 0.77a 1.09a — — — —
Xanthomonadaceae — — — — 7.75a 6.04a 12.93a 21.79a
属
Bradyrhizobium 28.85a 23.16ab 17.32ab 12.97b 2.19a 1.28a 1.19a 0.95a
Nitrosospira 8.94a 7.84a 8.82a 5.63a — — — —
Mesorhizobium 3.58a 4.93a 3.38a 1.16a — — — —
Achromobacter 0.09a 0.04a 0.61a 7.25a — — — —
Devosia 0.13a 0.11a 0.70a 1.03a — — — —
Rhodanobacter — — — — 7.75a 6.04a 12.93a 21.79a

注：数值表示三次重复平均值,“—”表示未检测到,每一行不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。

由PCoA分析可以看出（图4）,PC1和PC2两者之和对nirK型和nirS型反硝化细菌群落变异的解释度分别为58.01%和78.68%,且不同施肥处理对nirK型和nirS型反硝化细菌群落的影响具有一致规律,均体现为NoF和CF群落结构相似性较高,F+M和F+2M群落结构相似性较高。可见,有机肥施用可显著改变东北黑土nirK型和nirS型反硝化细菌群落结构,而单施化肥作用不明显。
图4 不同施肥处理东北黑土nirK和nirS型反硝化细菌PCoA分析

注：图中不同颜色椭圆为置信椭圆。

Fig. 4 Principal coordinates analysis (PCoA) of nirK and nirS denitrifying bacteria in different fertilizer treatments

nirK型和nirS型反硝化细菌具有明确分类的群落结构组成见表2。可以看出,不同施肥处理中nirK型比nirS型反硝化细菌多样性丰富,且分布相对集中,体现在nirK型反硝化细菌主要分布在3个纲、4个目、7个科和5个属,而nirS型反硝化细菌主要分布在3个纲、2个目、2个科和2个属（合并0.01%）。在纲水平,nirK型反硝化细菌主要为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria,占28.69%~38.14%）,其次为β-变形菌纲（Betaproteobacteria）和盐杆菌纲（Halobacteria）,而nirS型反硝化细菌则主要为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria,占6.04%~21.79%）,其次为Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria;在目水平,nirK型反硝化细菌主要为根瘤菌目（Rhizobiales,占26.84%~38.04%）,其次为盐杆菌目（Halobacteriales）、亚硝化单细胞目（Nitrosomonadales）和伯克氏菌目（Burkholderiales）,而nirS型反硝化细菌仅有黄色单胞菌目（Xanthomonadales）和根瘤菌目（Rhizobiales）;在科水平,nirK型反硝化细菌有7个已确定分类的科,分别为慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）、亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）、叶瘤杆菌科（Phyllobacteriaceae）、产碱菌科（Alcaligenaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）、盐杆菌科（Halobacteriaceae）和生丝微菌科（Hyphomicrobiaceae）,而nirS型反硝化细菌仅有Bradyrhizobiaceae和黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）两个可以确定的科;在属水平,nirK型反硝化细菌有 5个可以确定的属,其中慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium）相对丰度最高,且与NoF比较,单施化肥及化肥配施有机肥后其相对丰度均降低,F+2M处理其相对丰度显著减低122.43%（P<0.05）。nirS型反硝化细菌仅有Bradyrhizobium和罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）两个属,不同施肥处理间差异不显著。
上述菌属与土壤理化性质的相关性分析见图5。nirK型反硝化细菌中,除Nitrosospira属外,其余主要属均与某些理化性质表现出相关性,其中,Bradyrhizobium属对土壤理化性质变化表现最敏感,与土壤速效钾、硝态氮、pH、含水量、C∶N均呈显著相关关系（P<0.05）,与有效磷呈极显著相关关系（P<0.01）;其次为Devosia属,与土壤速效钾、有效磷、水溶性有机碳、硝态氮均呈显著相关关系（P<0.05）;Mesorhizobium属表现与pH极显著相关（P<0.01）,与速效钾显著相关（P<0.05）;Achromobacter属与pH显著相关（P<0.05）。而nirS型反硝化细菌中仅Rhodanobacter属含量与土壤速效钾、硝态氮、pH、含水量、C∶N显著相关,而另一个被检测出的Bradyrhizobium属则与土壤理化性质均不相关。证实nirK型反硝化细菌比nirS型反硝化细菌更易受到土壤理化性质变化的影响。
图5 土壤理化性质及DEA与nirK型和nirS型反硝化细菌主要菌属相关性

注：**、*分别表示P<0.01、P<0.05水平呈正相关。

Fig. 5 The correlations between soil properties and DEA with main genus of nirK and nirS denitrifying bacteria in farmland in black soil region of Northeast China

上述菌属与DEA的相关性分析结果表明,nirK型反硝化细菌中Bradyrhizobium属、Devosia属和DEA显著相关,而其他主要菌属与DEA未表现出显著相关,说明Bradyrhizobium属和Devosia属的成员可能与N2O释放有关。进一步分析Bradyrhizobium属和Devosia属的OTU表明,不同处理中Bradyrhizobium属的主要的OTU（数量≥10）共有 31个,其中27个OTU属于未分类Bradyrhizobium,其余归属为Bradyrhizobium diazoefficiens、Bradyrhizobium sp. GSM-471和Bradyrhizobium sp. ORS 278;Devosia属的OTU共有3个,全部隶属为Devosia sp. SGM 205,具体分布情况见图6。nirS型反硝化细菌中的Bradyrhizobium和Rhodanobacter与DEA没有相关性。
图6 不同处理隶属于Bradyrhizobium属和Devosia属的nirK型反硝化细菌OTU数量

Fig. 6 OTUs numbers of nirK denitrifying bacteria grouped in Bradyrhizobium and Devosia under different treatments

3 结论与讨论

3.1 结论

本文通过对不同施肥处理下东北旱田黑土nirK和nirS型反硝化细菌群落结构研究,证实了东北旱田黑土中nirK型反硝化细菌多样性高于nirS型反硝化细菌,Proteobateria是nirK型和nirS型反硝化细菌的优势菌门,在nirK型反硝化细菌中有少量Euryarchaeota存在;单施化肥对东北旱田黑土nirK型和nirS型反硝化细菌多样性无显著影响,但化肥配施有机肥后可显著增加其多样性和反硝化潜势,其中Bradyrhizobium属和Devosia属可能与东北旱田黑土N2O释放相关。除此,有机肥的施入可缓解土壤酸化、增加土壤速效钾、有效磷和养分含量,施用有机粪肥后导致的土壤硝态氮含量增加可能是增加土壤反硝化潜势的主导因素。因此,为更好地构建黑土数量、质量、生态“三位一体”的基本格局,针对本文结果,对我国黑土地的保护提出以下建议：
第一,积极推行种养结合,建立可循环农业体系。
农业有机肥主要来源于两方面,一是“种之废弃”。《东北黑土地保护规划纲要（2017—2030年）》提出加快农业废弃物资源化利用,增施有机肥,实行秸秆还田,增加土壤碳储存和腐殖质,增强黑土微生物活力是黑土保育的重点任务之一。另一是“养之废弃”。《农业农村部办公厅 财政部办公厅关于开展绿色种养循环农业试点工作的通知》（农办农〔2021〕10号）和《农业农村部办公厅 生态环境部办公厅关于进一步明确畜禽粪污还田利用要求强化养殖污染监管的通知》（农办牧〔2020〕23号）要求我国要推进畜禽养殖废弃物资源化利用,同时要加大环境监管力度,加快构建种养结合、农牧循环的可持续发展新格局。建议将秸秆粉碎深翻还田与种养结合畜禽粪污无害化处理还田同步作业,变“废”为“宝”,进而改良土壤结构,提升土壤地力,构建可循环的综合农业体系。
第二,适当配施有机肥料,调节黑土微生物活力。
增施有机肥可以调节黑土微生物活力。土壤微生物又是土壤肥力的“助力器”,对土壤肥力具有重要的“反哺”作用。旱田黑土中有机肥的施入不仅改变了土壤理化性质,也为土壤微生物提供了丰富的底物和能源,促进其生长繁殖,增加其生物多样性。因此建议,黑土旱田农业生长中,节约化肥投入,改进施肥方式,提高化肥利用率的同时配施有机肥,但在利用有机肥粪肥提高土壤养分保证土壤生产力的同时还应充分考虑有机肥过量施入对环境带来的负面效应。依据本文结果建议将有机粪肥施入量15 t·hm-2可作为该区域有机粪肥施入量的参考值。
第三,大力完善相关制度,营造科学管理新规范。
建议在推行黑土的畜禽粪还田利用过程中要逐步完善粪肥还田的管理制度,积极推动建立粪肥还田台账制度,对于粪肥使用量和使用时间进行要求,完善相关的行业标准和技术规范,坚持高位推动、科学布局;统筹实施种养循环农业试点、东北黑土保护利用试点、有机肥还田补贴等政策,以点带面,全面推广,实行综合治理,形成政策合力。同时加强日常监测,不仅掌握粪污等固态和液态成分的污染,同时要控制温室气体排放,降低过量有机粪肥还田的环境风险,进而实现科学的有机肥施用规范。
以有机质为核心的土壤质量退化是我国东北黑土地面临的重大问题,虽然国家已经制定黑土地保护和利用的战略决策,采用保护性耕作、秸秆还田、有机肥施用等措施阻控黑土地退化、提高土地产能,但是以上措施对黑土N2O排放的影响与机制研究仍是我国黑土地保护工作的重点,对构建我国黑土地提质增效与N2O减排的双赢局面有着重要的指导作用,对加快形成我国实现黑土地保护的全面立体格局,支撑东北黑土区粮食产能提升、实现“藏粮于地、藏粮于技”国家战略目标有着重要的理论和实践意义。

3.2 讨论

研究表明,土壤反硝化作用与土壤中的水溶性有机碳和有机氮含量密切相关[30,31],本文中虽然增施有机肥后水溶性有机碳含量降低,但变化并不显著,而硝态氮含量随有机肥施入的增加而显著升高,可为反硝化微生物作用提供更多的底物。可见,有机肥施入后土壤硝态氮含量的增加,可能成为其反硝化潜势增加的主导因素,从而影响黑土养分含量、温室气体的排放量和黑土健康。
第一,本文通过反硝化细菌功能基因nirK和nirS研究旱田黑土中反硝化细菌对不同施肥管理的响应,两种功能基因虽然在土壤反硝化作用中功能相近,但其菌株类型表现不同,与nirS型反硝化细菌相比,大多数环境样品中nirK型多样性更丰富[32],在本文中也得以证实。有研究推测可能由于nirK基因比nirS基因更易通过PCR扩增得到[19,33]。本文通过高通量测序发现东北黑土中nirK型和nirS型反硝化细菌主要菌门均为Proteobacteria,这与大部分已报道结果一致[22,34]。
第二,本文还发现Proteobacteria不仅在nirK和nirS型反硝化细菌中的分布丰度存在差异,而且部分类群细菌分布还具有特异性,例如,在纲、目和科水平上,Gammaproteobacteria、Xanthomonadales和Xanthomonadaceae仅存在于nirS型反硝化细菌;在目和科水平,Halobacteriales、Nitrosomonadales和Nitrosomonadaceae、Phyllobacteriaceae、Alcaligenaceae、Rhizobiaceae、Halobacteriaceae、Hyphomicrobiaceae则仅存在于nirK型反硝化细菌中。说明上述细菌成员仅含有nirK和nirS功能基因的一种,只能完成反硝化过程的部分反应步骤。而Bradyrhizobium属不仅在nirK型反硝化细菌中被检测到,同时在nirS型反硝化细菌群落结构中也被检测到,说明该菌属可能参与反硝化作用的全部反应步骤,是参与黑土反硝化作用中的重要微生物。相关性分析表明该菌属与土壤速效钾、有效磷、NO3-、pH、含水量、C∶N等多个理化性质以及反硝化潜势相关,后续可针对该菌属对黑土原位反硝化的贡献展开深入探讨。另外,不同施肥处理土壤中,nirK型反硝化细菌中有少量Euryarchaeota被发现,河流等环境中也曾发现此类反硝化细菌[35],且有研究证实Euryarchaeota可参与氮、硫、铁等多种循环,以及有机物降解和碳氢化合物转化等,在环境中占据着不同的生态位[36]。而关于Euryarchaeota在不同施肥处理中表现出的反硝化作用特征有待进一步研究。
第三,本文发现增施有机肥后土壤中nirK基因的Chao1指数、Shannon指数、ACE指数,nirS基因的Chao1指数和ACE指数均随之增加,且F+2M施肥处理增加效果显著。同时,与NoF比较,有机粪肥倍增（F+2M）时反硝化潜势增加量达77.27%,意味着有机肥的施入在提高土壤养分的同时,也会提高土壤反硝化作用,产生更多的N2O,给环境带来负面影响。化肥配施有机肥15 t·hm-2（F+M）处理的反硝化潜势与对照不施肥相比虽有增加,但未达到显著水平,说明有机粪肥施入量15 t·hm-2可作为该区域有机粪肥施入量的参考值。因此,在黑土保护的实施过程中,要加强土壤健康建设,强化耕地产能之本和可持续利用之能,从而实现黑土地耕地质量和生态共建共赢。

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